De Smedt: Ca: callibratieprocedure (p. 25)

Live forum: /viewtopic.php?t=4853

krln

05-06-2006 14:30:55

'OM het fluorescentiesignaal te calibreren inreele Ca concentratie-eenheden worden volgende stappen uitgevoerd:
blablabla
hier ben ik nimeer mee. Alles daarvoor snap ik wel, maar hier snap ik dan weer nimeer waarom eerste die opslagplaatsen lek gemaakt worden. En als complexatie door EGTA gebeurd heb je toch net wel fluorescentie, ookal is uw Ca zogezegd 'weg'. Hoe kan het dan dat je dan een minimale ratio hebt? En waarom die ionofoor?

Herlinde

05-06-2006 14:37:16

Als Calcium gebonden is aan EGTA zal het (blijkbaar) geen signaal geven... Dus als je alles bindt zal er geen signaal meer zijn.

De opslagplaatsen moeten lek gemaakt worden omdat je anders eventueel een opening van een kanaal uit een opslagplaats kan meten als 0, en dat klopt dan uiteraard niet: alle calcium moet volledig uit je cel verdwenen zijn, en dat is de nulmeting. Die ionofoor zorgt er dus voor dat je Calcium door de membranen van die opslagplaatsen in je cytoplasma raakt...

Is dit beetje duidelijker?

krln

05-06-2006 14:55:38

mja, maar die EGTA is toch net een Ca indicator, hoe wordt dan de fluorescentie gemeten?

Herlinde

05-06-2006 15:00:56

Je fluorescentie meet je door Fura-2; EGTA bindt Ca zodat het niet meer vrij aanwezig is in de cel om de fluorescentie te kunnen veranderen, het is een soort calciumbuffer...

Herlinde

05-06-2006 15:01:56

EGTA zelf is geen fluorescerend molecule, maar de fluoroforen zijn er wel op gebaseerd, mss dat je hierdoor in de war raakt?

krln

05-06-2006 15:17:54

ahaa, ok, inderdaad (slimme meid) :D

fikke

05-06-2006 15:25:28

ik was hier ook net aan het sukkelen

en we zitten nog maar aan hoofdstuk 2 :cry:

Herlinde

05-06-2006 15:27:45

slimme meid
:feest :sopleased: :feest :sopleased: :feest :sopleased: :feest :sopleased:

vlien

05-06-2006 15:56:41

en wrm lees je dan bij 375 nm sf2 en sb2? da heb ik nog ni door precies

en wanneer doede der dan uwe fura bij? ik snap het ook ff ni.
ik dacht da ge gewoon de verhouding van die bovenste grafiek moest pakken op de tweede en da je dan de onderste krijgt.

Herlinde

05-06-2006 16:10:35

en wrm lees je dan bij 375 nm sf2 en sb2? da heb ik nog ni door precies
waarom dat dat bij 375nm moet weet ik ook niet, conventie of zo??? In ieder geval is het zo dat bij 375nm de intensiteit omgekeerd evenredig is met de concentratie calcium, dus als de intensiteit maximaal is, is er een minimale hoeveelheid (geen dus als het ideaal is) Calcium aanwezig. Bij een minimale intensiteit is er een maximale hoeveelheid Calcium aanwezig (of is fura volledig bezet zodat je een maximale fluorescentie krijgt)

Dus om Sf2 te meten voeg je er veel EGTA aan toe zodat alle calcium weg is en je kan meten hoe de intensiteit daar ligt.
Om Sb2 te meten voeg je er een overmaat Calcium aan toe, zodat alle EGTA verzadigd is en alle fura bezet is, dan krijg je de maximale intensiteit...

en wanneer doede der dan uwe fura bij? ik snap het ook ff ni.
ik dacht da ge gewoon de verhouding van die bovenste grafiek moest pakken op de tweede en da je dan de onderste krijgt.

Fura zit er de hele tijd al bij, je doet de hele tijd metingen hé.
En ja, idd, de verhouding van de bovenste 2 geeft de onderste

Hopelijk nu toch ietsje duidelijker?

vlien

05-06-2006 16:15:12

het begint te komen ja

Herlinde

05-06-2006 16:21:42

Je laat het maar weten en dan doe ik eventueel wel nog een poging :wink: vind dat heel handig om te weten hoeveel ik er zelf van snap... :)

krln

05-06-2006 16:23:40

blijkbaar, herlinde is onze levende encyclopedie

Herlinde

05-06-2006 16:24:49

:oops: ben hier nu heel rood aant worden achter menne pc :oops:

fikke

05-06-2006 18:59:05

en in datzelfde hoofdstuk: hoe kom je in die vergelijkingen plots aan die Sf2 en Sb2. Moeten wij nu die logische stap zien om dat af te leiden?? Ik zie hem toch niet hoor... :roll:

Herlinde

06-06-2006 06:04:32

Denk dat de logische stap overgeslagen is, het is nu gewoon nog een extra van-buiten-blok stap :roll:
Het enige dat ik er nog van kan zeggen is dat bij die vergelijking met F dat je daar de absolute intensiteiten gebruikt, maar omdat dat blijkbaar niet gemakkelijk te meten is of zo, gebruiken ze dan die R en S, en dat is dan een relatieve maat...

fikke

06-06-2006 06:21:52

tjah, ik begon al te vrezen dat dit antwoord ging komen: 'gewoon vanbuiten blokken'

met 1 iets gaat dat wel, maar als er nog veel van die dingen komen schrap ik dat 8)

Herlinde

06-06-2006 06:30:41

Sorry ze, kan er zelf ook geen echte logica in vinden, moest et nog komen, kzal het laten weten :wink:

vlien

06-06-2006 07:18:26

eum, ff ter informatie, die sf2 en sb2 staan voor de vrije en gebonden indicator niet voor calcium (al is dat wel een beetje hetzelfde) maar ik dacht dus dat als je die EGTA toevoegt, dan bindt alle ca aan EGTA en dan is dus al u indicator vrij en dat zie je bij die 375 nm?

Herlinde

06-06-2006 07:24:59

Ja dat is denk ik wel juist, en alle signaal dat je dan krijgt is niet specifiek, en op die manier kan je dan u meting calibreren?