Humane Genetica: Technieken

Live forum: /viewtopic.php?t=4550

Herlinde

30-05-2006 11:23:10

Hallo!

dit is hopelijk mijn laatste vraagje over humane genetica...

Bij de techniek van third wave (met dat FLAP-ding); hoe kan je daar het verschil zien tussen de 4 basen? Ik veronderstel dat er voor elke base een verschillende FRETcassette is met voor elk een verschillend kleur?

Mercikes!

Anonymous

18-06-2006 12:14:17

Bij je primaire probe maakt het uit welke base het is. Je hebt telkens een andere probe nodig afhankelijk van het onderzoek.

Maar ik denk dat je telkens dezelfde (soort/sequentie) FRET-cassette kan gebruiken.
Volgens mij bindt je cleaved flap aan je FRET-cassette omdat die cassette de flap herkent. ('t is trouwens voor elk experiment dezelfde flap). Die ene base die er dan nog aanhangt zal het verschil wel niet maken of er binding is of niet.

De mutaties worden enkel herkend door de primaire probe. De FRET-cassette dient enkel voor de labeling. Als er een mutatie is bindt de primaire probe niet, heb je dus ook geen flag en wordt je FRET-cassette dus niet geknipt en is er dus geen signaal.

Ik hoop dat mijn uitleg begrijpelijk is en klopt. Kan iemand het bevestigen?

Herlinde

18-06-2006 12:27:52

Als je telkens dezelfde cassette moet gebruiken, dan kan je toch geen onderscheid maken tussen A,T,G & C???
Daar zit mijn probleem: je wil bepalen welke SNP het is, maar je hebt geen manier om een onderscheid te maken. Je zegt dat door die ene base het verschil gemaakt word, maar dan moet dat zogezegd in elk experiment dezelfde base zijn... Dat kan toch niet?

Anonymous

18-06-2006 14:18:31

Er moet ook nog geknipt worden eh!
Alé ik dacht dat het zo zat:
je hebt dus uw primaire probe je laat die annealen dan knipt ge die 3 strengen en enkel als er geknipt is dan kan uwe Fret binden en fluorisceren. En er kan enkel geknipt worden in uw primaire probe als deze een welbepaalde base heeft die overeenkomt ofzo....
Maar dat is dus compleet fout wss.
en diee flap die is toch nodig zodat uwe fret kan annealen met uw probe eh?
Dus waarom dat knippen?
En uwe fret die kan toch uw probe niet binden als deze geanneald is met uw target DNA?

k snap de techniek gewoon niet

Herlinde

18-06-2006 15:01:52

Dit is wat ik ervan snap:

ge hebt dus u target DNA en een oligo die daarop past. Dan hebt ge nog een primaire probe met een stukje aan.
Dat target DNA, die oligo en die primaire probe zijn volgens mij uniek, en dat stukje (paars op de tekening) is standaard.

Nu hebt ge een enzyme dat knipt als het DNA 3strengig is, dus dan krijgt ge dat stukje paars, dat standaard is, met dat stukje groen er nog aan, en dat is uniek, want het past op het targetDNA...

Nu stop je dat groen-paars geval in die blauwe cassette, en die is ook voor alle dingen gelijk. Door dat dat overklapt, krijg je opnieuw 3strenging DNA en zal u enzyme daar knippen.
Doordat uwe quencher en uwe fluo door dat knippen gescheiden worden, gaat ge fluorescentie krijgen.

Het enige dat ik niet echt snap is dan hoe je het onderscheid kan maken tussen een A T C G; maar ik dacht mss een aparte cassette en dus eventueel een andere kleur???

Snap je het al wat beter op die manier?
(Dat knippen de eerste keer is nodig omdat anders dat groen geval te lang is en dat het dus niet in u blauwe cassette-FRET geval zal passen)

Anonymous

18-06-2006 16:28:30

Ik wist niet dat de third wave gebruikt werd voor SNP detectie. (dus bedankt nu weet ik al iets meer)
Maar pure gok: mss als je weet wat je toevoegt van primer, weet je ook wat er licht zal geven. En als 't niet past heb je geen signaal en moet je je primer die niet past opruimen en een andere proberen? (type pyrosequencing?)

Maar ik denk dat je uitleg beter is, Herlinde. maar ik kan ze wel niet bevestigen.

Puuuuuuuuuuuuuuuuuuuuuure gok!!!!
K zit er wsl compleet naast

(en op internet vind ik die uitleg ook nergens :( )

Herlinde

18-06-2006 16:37:59

Maar pure gok: mss als je weet wat je toevoegt van primer, weet je ook wat er licht zal geven. En als 't niet past heb je geen signaal en moet je je primer die niet past opruimen en een andere proberen? (type pyrosequencing?)
Mja, mss, maar denk dat dat er meer uitdrukkelijk zou hebben bijgestaan, das nogal vergezocht (wel mogelijk!) om er nie bij te zetten?

veel succes nog!